Editat per Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, Califòrnia, aprovat el 25 de desembre de 2020 (revisat el 25 d'octubre de 2020)
Informem de la interacció entre subunitats en la replicació de complexos de transcripció coronavirus, que són essencials per a la replicació i la conservació evolutiva.Vam proporcionar proves que el domini NiRAN associat a nsp12 té activitat transferasa de nucleòsid monofosfat (NMP) en trans i vam identificar nsp9 (una proteïna d'unió a l'ARN) com a objectiu.NiRAN catalitza la unió covalent de la part NMP a l'extrem amino terminal nsp9 conservat en una reacció que es basa en ions Mn2 + i residus d'Asn conservats adjacents.Es va trobar que l'activitat de NiRAN i la NMPylation nsp9 són essencials per a la replicació del coronavirus.Les dades ens permeten vincular aquesta activitat del marcador enzimàtic del virus niat amb les observacions anteriors en la hipòtesi que l'inici de la síntesi d'ARN en una classe de virus d'ARN és coherent funcional i evolutivament.
L'ARN polimerasa depenent de l'ARN (RdRps) de Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae i 12 famílies més) està vinculada al domini amino-terminal (N-terminal) de la proteïna no estructural (nsp) alliberada de la poliproteïna, anomenada NiRAN. 1ab es compon de proteasa principal viral (Mpro).Anteriorment, es va informar de l'activitat GMPylation/UMPylation del virus arterial NiRAN-RdRp nsp, i es va suggerir generar un transitori per a la transferència de monofosfat de nucleòsids (NMP) al virus (actualment desconegut) i/o coses de biopolimerització cel·lular.Aquí, mostrem que el coronavirus (coronavirus humà [HCoV]-229E i síndrome respiratòria aguda severa Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) té activitat de NMPylation dependent de Mn2+, que es deriva de nsp9 mitjançant la formació de nsp9 mediada per Mpro després el N-terminal flanquejant nsps s'allibera proteolíticament, el fosforamidat s'uneix a l'amina primària (N3825) a l'N-terminal de nsp9.El trifosfat d'uridina és el nucleòtid preferit en aquesta reacció, però el trifosfat d'adenosina, el trifosfat de guanosina i el trifosfat de citidina també són cosubstrats adequats.Els estudis de mutació utilitzant proteïnes recombinants de coronavirus nsp9 i nsp12 i mutants HCoV-229E modificats genèticament van determinar els residus necessaris per a la NMPylation nsp9 mediada per NiRAN i la replicació del virus en cultiu cel·lular.Les dades van confirmar la predicció dels residus del lloc actiu de NiRAN i van determinar el paper important dels residus nsp9 N3826 en la NMPylation nsp9 i la replicació del virus in vitro.Aquest residu forma part de la seqüència de tripèptid NNE N-terminal conservada i va demostrar ser l'únic residu invariant de nsp9 i els seus homòlegs a la família del coronavirus.Aquest estudi proporciona una base sòlida per a l'estudi funcional de l'activitat de NMPylation d'altres virus nius i proposa possibles objectius per al desenvolupament de fàrmacs antivirals.
El virus d'ARN de cadena positiva Nidovirales infecta una varietat de vertebrats i invertebrats (1, 2).L'ordre inclou actualment 14 famílies (3), de les quals la família del Coronavirus ha estat àmpliament estudiada en els últims 20 anys.En aquell moment, tres coronavirus zoonòtics van sorgir d'hostes animals i van provocar brots a gran escala d'infeccions respiratòries greus en humans.Incloses les pandèmies persistents causades per malalties infeccioses agudes greus.Síndrome Respiratòria Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Els nidovirus comparteixen una organització del genoma comuna, i la subunitat del complex de replicació-transcripció lligat a la membrana (RTC) està codificada als dos terços 5-?²-terminals i la subunitat estructural principal de la partícula del virus, així com alguns accessoris. .Proteïna, codificada al terç final 3??² del genoma (1).Excepte una família de virus planaris (Monoviridae) (8), tots els virus imbricats codifiquen subunitats RTC en dos grans marcs de lectura oberts (ORF) ORF1a i ORF1b, que es tradueixen a partir de l'ARN genòmic de.ORF1a codifica la poliproteïna (pp) 1a, i ORF1a i ORF1b codifiquen conjuntament pp1ab.Amb la participació general de la proteasa principal (Mpro) codificada per ORF1a, tant pp1a com pp1ab es processen proteolíticament en una varietat de proteïnes no estructurals (nsps), també conegudes com 3CLpro, perquè té homologia amb el 3Cpro del picornavirus ( 9).Es creu que aquests nsps s'agrupen en un gran RTC dinàmic, catalitzen la síntesi d'ARN genòmic (replicació) i un conjunt d'ARN subgenòmic (transcripció) i s'utilitzen per coordinar l'expressió de l'ORF situat aigües avall d'ORF1b (10?? ?12).
El nucli RTC inclou l'ARN polimerasa depenent de l'ARN (RdRp) (13), la superfamília 1 helicasa (HEL1) (14, 15) i diversos enzims de processament d'ARN, que estan codificats principalment a ORF1b i a la família de coronavirus. Conté nsp12-nsp16 i nsp9-nsp12 de la família Arterioviridae (vegeu referència 10ââ 12).RdRp i HEL1 representen dos dominis conservats (una cinquena part) del virus del niu de l'ocell i tenen homologia entre altres virus d'ARN.Es creu que la replicasa central està assistida per altres subunitats, incloses diverses petites nsps alliberades de la regió carboxi-terminal (C-terminal) de pp1a, aigües avall de Mpro (coronavirus nsp5 i virus arterial nsp4, respectivament).Tenen una protecció específica familiar limitada i activitats diverses (revisat a la referència 10ââ12).
Fa relativament poc, es va trobar un domini amb característiques de motiu de seqüència úniques a l'extrem amino terminal (N-terminal) adjacent a RdRp en tots els virus nidificats, però en cap altre virus d'ARN (16).Segons la seva ubicació i l'activitat de la transferasa de nucleòtids (nucleòsid monofosfat [NMP] transferasa), aquest domini s'anomena NiRAN (transferasa de nucleòtids relacionada amb Nestvirus RdRp).La combinació de doble domini de NiRAN-RdRp constitueix nsp12 a la família Coronaviridae i nsp9 a la família Arterioviridae, i en altres nestoviridae, s'espera que NiRAN-RdRp s'alliberi com a nsp independent de la poliproteïna viral.En el coronavirus, el domini NiRAN conté residus ??1/450 i està connectat al domini RdRp C-terminal a través de la regió de l'enllaç (16-19).En el virus de l'arteritis equina (EAV) (Arteriviridae), la nsp9 recombinant mostra activitats d'UMPylation i GMPylation (auto) dependents d'ions Mn2+, que depenen de tres bases de seqüència conservades en nestovirus, AN, BN i CN Els residus de la seqüència.On N significa NiRAN) (16).El flanqueig N-terminal d'aquests motius és un motiu menys conservador preAN.Alguns d'aquests residus també es conserven en proteïnes quinases relacionades a distància, on s'ha demostrat que estan implicats en la unió de nucleòsids trifosfat (NTP) i en l'activitat catalítica (20, 21).D'acord amb aquesta observació, es poden reunir diversos residus clau del lloc actiu de la pseudoquinasa SelO de Pseudomonas syringae amb el supercomplex SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 publicat recentment.Residus de Coronavirus NiRAN conservats superposats a la microestructura electrònica.Proteïna recombinant (17).S'especula que la documentada (auto)U/GMPylation produirà un estat transitori per transferir NMP al substrat (actualment desconegut) (16), i la similitud estructural entre NiRAN i proteïna quinasa (17, 19) és la hipòtesi que NiRAN modifica altres proteïnes.
Moltes característiques, inclosa la seva associació sistemàtica única i única amb virus nidificats i la separació genètica de RdRp, fan que NiRAN sigui un enzim regulador clau raonable per als virus nidificats, que és fonamental per a la seva aparició i identitat.Anteriorment, es van anomenar tres possibles funcions que implicaven NiRAN per regular la traducció del genoma/subgenòmica o la replicació/transcripció.Quan es tenen en compte les dades escasses i incompletes disponibles en aquell moment, cada funció té els seus avantatges i inconvenients (16).En aquesta investigació, pretenem combinar els estudis bioquímics i genètics inversos dels coronavirus que representen els dos gèneres, i posar les nostres troballes en el rerefons evolutiu de la mutació natural de la família del coronavirus, per tal d'aprofundir en aquest regne misteriós.Informem d'importants avenços en la comprensió de NiRAN mitjançant la identificació d'objectius naturals en RTC, que (entre les tres hipòtesis disponibles) contribueix al paper d'aquest domini a l'hora d'iniciar la síntesi d'ARN del virus imbricat.Aquesta investigació també obre possibilitats per a altres funcions de NiRAN a la interfície de l'amfitrió del virus.
Per caracteritzar les propietats enzimàtiques del domini NiRAN relacionat amb el virus de la corona nsp12, vam produir una forma recombinant de coronavirus humà 229E (HCoV-229E) nsp12 a E. coli, amb una etiqueta His6 a l'extrem C, i vam combinar el proteïna amb [α32-P] Incubar juntament amb NTP en presència de MnCl2 tal com es descriu a Materials i mètodes.L'anàlisi del producte de reacció va indicar la presència d'una proteïna radiomarcada que comigra amb nsp12 (106 kDa), cosa que indica que el coronavirus nsp12 catalitza la formació d'aductes proteïnes-NMP covalents, formats preferentment amb monofosfat d'uridina (UMP) (Figura 1A) i B).L'anàlisi quantitativa va mostrar que, en comparació amb altres nucleòtids, la intensitat del senyal d'incorporació d'UMP va augmentar de 2 a 3 vegades (figura 1C).Aquestes dades són coherents amb l'activitat de transferasa NMP prevista del domini NiRAN del coronavirus (16), però indiquen que les preferències de nucleòtids del domini NiRAN del coronavirus i del virus arterial són diferents.
Activitat d'auto-NMPylation de HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) es va incubar amb el [α-32P] NTP designat en presència de 6 mM MnCl2 durant 30 minuts (vegeu Materials i mètodes per obtenir més informació).Els productes de reacció es van separar mitjançant SDS-PAGE i es van tenyir amb blau brillant de Coomassie.(B) La proteïna radiomarcada es visualitza mitjançant imatges de fòsfor.Les posicions dels marcadors de massa molecular de nsp12-His6 i proteïnes (en kilodaltons) es mostren a A i B. (C) La intensitat del senyal radioactiu (mitjana ± SEM) es va determinar a partir de tres experiments independents.*P≤0,05.La intensitat del senyal (percentatge) està relacionada amb UTP.
Tot i que s'ha demostrat que les activitats enzimàtiques relacionades amb NiRAN són essencials per a la replicació d'EAV i SARS-CoV en cultiu cel·lular (16), encara no s'han determinat la funció específica de NiRAN i els objectius potencials.La semblança estructural recentment reportada entre NiRAN i una família de proteïnes amb plecs semblants a proteïnes cinases (17, 22) ens va impulsar a provar la hipòtesi que NiRAN catalitza la NMPil·lació d'altres proteïnes.Hem generat un conjunt d'objectius homòlegs potencials, incloses proteïnes no estructurals codificades per HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), cadascuna conté una etiqueta His6 C-terminal (apèndix SI, taula S1) i incubar aquestes proteïnes amb [α32-P] uridina trifosfat ([α32-P]UTP) en presència o absència de nsp12.L'albúmina sèrica bovina i la proteïna de fusió MBP-LacZα produïda a E. coli van servir de controls (figura 2A, carrils 1 a 7).La proteïna radiomarcada es va analitzar mitjançant electroforesi en gel de dodecilsulfat de sodi-poliacrilamida (SDS-PAGE) i autorradiografia, i es va trobar que hi havia un fort senyal radioactiu a la reacció que contenia nsp12 i nsp9.La posició del senyal correspon a la massa molecular de nsp9, cosa que indica la UMPylation de nsp9 mediada per nsp12 (figura 2B, pista 7).No es va trobar cap altra proteïna de prova UMPilated, cosa que ens va portar a concloure que nsp9 és un substrat específic de nsp12.D'acord amb les dades d'auto-NMPylation que es mostren a la figura 1, nsp12 és capaç de transferir els quatre NMP a nsp9, tot i que l'eficiència és diferent, UMP> monofosfat d'adenosina (AMP)> monofosfat de guanosina (GMP)> monofosfat de citidina (CMP)) ( imatge).3 A i B).En les condicions utilitzades en aquest assaig (escurçar el temps de reacció i exposició, reduir la concentració de nsp12; materials i mètodes), no es va poder detectar l'auto-NMPylation de nsp12 (compareu la figura 2B, el carril 7 i la figura 1B), que va resultar eficaç (i múltiples rondes) UMP va passar de nsp12 a nsp9.L'activitat de la transferasa UMP requereix la presència d'ions Mn2 +, tal com es mostra a la figura 3C, mentre que només es va observar una activitat de transferasa UMP mínima en presència de Mg2 + i cap activitat en presència dels altres dos cations divalents provats.Es van obtenir dades similars en assajos de NMPylation que contenien citidina trifosfat (CTP), guanosina trifosfat (GTP) i adenosina trifosfat (ATP) (apèndix SI, figura S1).
UMPilació de nsp9 mediada per HCoV-229E nsp12.Es van utilitzar una sèrie de substrats proteics (incloent l'albúmina sèrica bovina, MBP-lacZα i una sèrie de nsps HCoV-229E marcats amb His6 C-terminal codificat per ORF1a) per avaluar l'activitat de UMPylation de HCoV-229E nsp12-His6⁺ mediada. proteïna.Incubeu la proteïna amb [α-32P] UTP durant 10 minuts en absència (A) o presència (B) de nsp12 tal com es descriu als materials i mètodes.A la part superior de A i B, es mostra el gel SDS-poliacrilamida tenyit amb Coomassie Brilliant Blue, i a la part inferior de A i B, es mostren els autoradiogrames corresponents.La posició del marcador de massa molecular de proteïnes (en kilodaltons) es dóna a l'esquerra.També s'indica la posició de nsp12-His6 (B, superior) i el senyal radioactiu observat durant la incubació de nsp12-His6 amb nsp9-His6 (B, carril 7), cosa que indica que [α-32P]UMP a nsp9-His6 (12,9 kDa), que no es va observar per a altres proteïnes provades.
Caracterització bioquímica i virològica mediada per HCoV-229E NiRAN de la NMPylation nsp9.(A i B) El paper del cosubstrat de nucleòtids utilitzat en la reacció.Nsp12-His6 i nsp9-His6 es barregen i s'incuben en presència de diferents [α-32P] NTP en l'assaig estàndard de NMPylation.(A, a dalt) nsp9-His6 tenyit de Coomassie separat per SDS-PAGE.(A, inferior) Autorradiografia de la mateixa zona del gel.(B) L'activitat relativa (mitjana ± SEM) en presència del cofactor de nucleòtids designat es determina a partir de tres experiments independents.*P≤0,05.(C) El paper dels ions metàl·lics.Es mostra la prova estàndard de NMPylation en presència de [α-32P] UTP i diferents ions metàl·lics, cadascun amb una concentració d'1 mM.A C, a la part superior, es mostra nsp9-His6 tacat de Coomassie, i a C, a la part inferior, es mostra l'autorradiografia corresponent.La mida de la proteïna marcada (en kilodaltons) es mostra a l'esquerra de A i C. (D) La forma mutant de HCoV-229E nsp12-His6 que porta la substitució d'aminoàcids especificada es troba a [α-32P]UTP, tal com es descriu. en Materials i Mètodes.El nsp9-His6 radiomarcat produït a la reacció de NMPylation es detecta mitjançant imatges de fosforilació (D, a dalt).L'activitat relativa en comparació amb la proteïna de tipus salvatge (pes) es mostra a D, i la part inferior es pren com a mitjana (± SEM) de tres experiments independents.Els asteriscs indiquen substitucions de residus no conservats.(E) El títol de virus en el sobrenedant de cultiu de cèl·lules p1 obtingut 24 hores després de la infecció es va determinar mitjançant un assaig de placa.S'indiquen les substitucions de codons al domini NiRAN del mutant HCoV-229E dissenyat (la numeració de residus es basa en la seva posició a pp1ab).El mutant del lloc actiu RdRp amb deficiència de replicació nsp12_DD4823/4AA es va utilitzar com a control.
Per tal d'aprofundir en la comprensió del lloc actiu de NiRAN i determinar els residus relacionats amb l'activitat de la transferasa NMP específica de nsp9, vam realitzar una anàlisi de mutacions, en la qual vam substituir els residus conservadors en els motius NiRAN AN, BN i CN ( 16) És Ala (apèndix SI, figura S2).A més, es va avaluar l'impacte de les substitucions conservadores Arg-to-Lys o Lys-to-Arg en dos casos.Com a control (negatiu), els residus que no es conserven o menys al domini NiRAN dels coronavirus i altres virus nius es substitueixen per Ala. Substitució de K4116A (en motiu preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motiu). BN) i D4280A (CN) redueix significativament o fins i tot elimina la NMPylation de nsp9 a través de nsp12, mentre que les proteïnes amb substitucions conservadores (R4178K), K4116R) retenen el 60% i el 80% de la seva activitat, la qual cosa indica que la relaxació de les restriccions del seu costat respectiu cadenes és fisicoquímicament sensible (figura 3D).La substitució de diversos altres residus conservats E4145A, D4273A, F4281A i D4283A és molt menys nociu, i la UMPilation de nsp9 només es redueix moderadament.Es van obtenir resultats similars en reaccions de NMPylation nsp9 que impliquen altres NTP (figura 3D i apèndix SI, figura S3), confirmant que els efectes observats en substitucions específiques d'aminoàcids són independents del tipus de cosubstrat de nucleòtids utilitzat.A continuació, vam provar el possible impacte d'aquestes substitucions de nsp12 en la replicació de coronavirus en cultiu cel·lular.Amb aquesta finalitat, hem utilitzat plantilles d'ADN complementari (ADNc) dissenyades genèticament adequades clonadas en el virus de la vacuna recombinant (23, 24) per transcriure 5 -7 cèl·lules.La valoració de la descendència del virus infecciosa produïda en aquestes cèl·lules va demostrar que la majoria de mutants NiRAN HCoV-229E no eren factibles (figura 3E).Un grup de mutants virals no viables inclou alternatives que s'ha demostrat que eliminen o redueixen significativament l'activitat de la transferasa de NMP in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), però hi ha altres dues alternatives (K4116R, E4145A) % reservat?La seva activitat de NMPylation in vitro suggereix que hi ha restriccions addicionals.De la mateixa manera, altres dues mutacions (R4178K, F4281A) que van provocar una disminució moderada de l'activitat de NMPylation in vitro de NiRAN van produir virus vius, però, aquests virus van reduir significativament els títols mitjançant la replicació.D'acord amb les dades d'activitat in vitro que es mostren a la figura 3D, la substitució de quatre altres residus que no es conserven en el coronavirus i/o altres virus imbricats (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) va produir virus viables La descendència, tot i tenir un títol moderadament reduït en comparació amb el virus de tipus salvatge (figura 3E).
Per tal d'estudiar si l'activitat de la transferasa NMP mediada per NiRAN depèn del domini RdRp actiu, els dos residus Asp conservats implicats en la coordinació d'ions metàl·lics divalents (11) en el motiu C de RdRp van ser substituïts per Ala. La proteïna resultant nsp12_DD4823/4AA conserva la seva activitat de NMPylation nsp9, que indica que l'activitat de NMPylation nsp9 in vitro mediada per nsp12 no requereix activitat de polimerasa (apèndix SI, figura S4).
Després d'establir l'activitat de transferasa NMP específica de nsp9 per a nsp12, vam intentar caracteritzar l'aducte NMP-nsp9 mitjançant espectrometria de masses (MS).L'espectre complet de masses de proteïnes del recombinant HCoV-229E nsp9 va mostrar un pic a 12.045 Da (figura 4A).L'addició de nsp12 no va canviar la qualitat de nsp9, cosa que indica que nsp12 i nsp9 no formarien un complex estable en les condicions utilitzades (desnaturalització) (figura 4A).En presència d'UTP i GTP, la mesura de la massa de la reacció que contenia nsp9 i nsp12 respectivament va mostrar que la massa proteica d'UTP es va moure 306 Da i la massa proteica de GTP es va moure 345 Da, cosa que indica que cada molècula de nsp9 s'uneix a un UMP o GMP. (Imatge 4) C i D).S'especula que l'energia necessària per a la NMPylation nsp9 mediada per NiRAN prové de la hidròlisi de NTP i l'alliberament de pirofosfat.Tot i que en aquesta reacció es va utilitzar un excés molar de 10 vegades de nsp9 (objectiu) que nsp12 (enzim), es va observar una NMPylation gairebé completa de nsp9, cosa que indica que la interacció entre nsp12 i nsp9 és de curta durada i que nsp12 pot NMPilar més nsp9. molècula in vitro.
NMPilació única de nsp9 en presència de nsp12 i UTP o GTP.Es mostra l'espectre de masses proteic complet desconvolut de HCoV-229E nsp9 (apèndix SI, taula S1) (AD).(A) nsp9 sol, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 en presència d'UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 en presència de GTP.
Per determinar els residus de nsp9 UMPilats per nsp12, nsp9-UMP es va escindir amb tripsina.Els pèptids resultants es van separar mitjançant nanocromatografia líquida d'alt rendiment (HPLC) i es van analitzar mitjançant espectrometria de masses en tàndem (MS/MS) en línia.L'anàlisi de dades mitjançant el paquet de programari Byonic (Protein Metrics) va mostrar la UMPylation de l'aminoàcid N-terminal.Això es confirma manualment.L'espectre de masses en tàndem del pèptid precursor [UMP] NNEIMPGK (apèndix SI, figura S5A) va revelar un fragment a 421 m/z, cosa que indica que UMP s'uneix al residu 1 de nsp9.
A l'extrem N-terminal de nsp9, Asn es conserva entre els membres d'Orthocoronavirinae (apèndix SI, figura S6).Tot i que creiem que el nitrogen de l'amina primària N-terminal és l'acceptor més probable de l'UMP, vam decidir obtenir proves addicionals de la unió de NMP a l'N-terminal.Per aquest motiu, el pèptid N-terminal no NMPilat i NMPilat nsp9 purificat per HPLC es va derivar en presència d'acetona i cianoborohidrur de sodi.En aquestes condicions, només les amines primàries lliures es poden modificar amb propil (25).El pèptid N-terminal derivat de nsp9 amb la seqüència NNEIMPGK conté dues amines primàries, una a l'extrem N-terminal d'Asn i l'altra a la cadena lateral de Lys a l'extrem C-terminal.Per tant, es poden introduir grups propis als dos extrems.Els cromatogrames iònics extrets de pèptids no NMPilats es mostren a l'apèndix SI, figura S5B.Com era d'esperar, es poden identificar pèptids N-terminals i C-terminals (mono)propilats (apèndix SI, figura S5B, carril superior) i pèptids dipropilats (apèndix SI, figura S5B, carril inferior).Aquest patró canvia amb l'ús del pèptid N-terminal NMPilat de nsp9.En aquest cas, només es poden identificar pèptids propilats C-terminals, però no s'identifiquen els pèptids propilats N-terminals i els pèptids dipropilats (apèndix SI, figura S5C), cosa que indica que l'UMP s'ha transferit a l'amina primària N-terminal Per evitar-ho. grup de fer canvis.
A continuació, substituïm (amb Ala o Ser) o suprimim els residus conservats a l'extrem N-terminal de nsp9 per definir restriccions específiques de l'objectiu.A partir de les nostres dades de MS que mostren que NiRAN forma un adducte nsp9-NMP amb l'amina primària del residu N-terminal de nsp9, vam plantejar la hipòtesi que la NMPylation nsp9 requereix que la proteasa mestra viral (Mpro, nsp5) alliberi l'N-terminal de nsp9 de el seu precursor poliproteic.Per provar aquesta hipòtesi, vam produir una proteïna precursora nsp7-11 que contenia nsp9 a E. coli i vam realitzar una prova estàndard de NMPylation en presència de [α-32P] UTP (materials i mètodes).Com es mostra a la figura 5A (carril 3), el precursor nsp7-11 sense tallar no està radiomarcat amb nsp12.En canvi, si nsp7-11 és escindit per nsp5 recombinant per alliberar nsp9 (i altres nsps) del precursor, es detecta una proteïna radiomarcada que migra amb nsp9, confirmant la nostra conclusió que NiRAN i la formació N-selectiva d'aductes nsp9-NMP covalents .L'amina primària terminal de l'Asn N-terminal (posició 3825 a pp1a/pp1ab).Aquesta conclusió també es recolza en experiments que utilitzen la construcció nsp9, que conté un o dos residus addicionals a l'extrem N-terminal.En ambdós casos, es va abolir la UMPylation de nsp9 mediada per NiRAN (apèndix SI, figura S7).A continuació, vam produir una proteïna amb un o dos residus d'Asn eliminats de la seqüència de pèptids 3825-NNEIMPK-3832 a l'N-terminal de nsp9.En ambdós casos, la UMPylation de nsp9 es va bloquejar completament (figura 5B), proporcionant proves addicionals que l'extrem N-terminal real de nsp9 actua com a receptor NMP.
El processament proteolític de nsp9 i el paper dels residus N-terminals en la UMPilació mediada per nsp12.(A) nsp9 UMPylation requereix un N-terminal lliure nsp9.Nsp7-11-His6 s'incuba prèviament a 30 °C en un tampó de detecció de NMPylation que conté UTP en presència o absència de Mpro recombinant (nsp5-His6).Després de 3 hores, inicieu l'assaig de NMPylation afegint nsp12-His6 tal com es descriu a Materials i mètodes.La reacció que contenia nsp5-His6 (carril 1) i nsp9-His6 (carril 2) es va utilitzar com a control.Després de 10 minuts, la reacció es va acabar i la barreja de reacció es va separar mitjançant SDS-PAGE.La proteïna es va tenyir amb Coomassie Brilliant Blue (A, superior).A la dreta es mostren el precursor Nsp7-11-His6 i el producte processat resultant de la divisió mediada per nsp5-His6.Tingueu en compte (a causa de la seva petita mida) que nsp7 i nsp11-His6 no es poden detectar en aquest gel, i la reacció es complementa amb nsp5-His6 (carrils 1 i 4; la posició de nsp5-His6 s'indica amb un cercle sòlid) o nsp9-His6 (Carril 2) conté una petita quantitat de MBP (indicada per cercles oberts) com a impureses residuals perquè s'expressen com a proteïnes de fusió MBP (apèndix SI, taula S1).(B) La variant Nsp9-His6 no té un o dos residus d'Asn N-terminals (numeració de residus segons la posició a pp1a/pp1ab) i es purifica i s'incuba amb nsp12-His6 i [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE tacat amb Coomassie es mostra a la part superior, B, es mostra l'autorradiografia corresponent a la part inferior.La posició del marcador de pes molecular (en kilodaltons) es mostra a l'esquerra.(C) Els residus conservats N-terminals de HCoV-229E nsp9-His6 es van substituir per Ala o Ser, i es va utilitzar la mateixa quantitat de proteïna a la reacció d'UMPylation mediada per nsp12-His6.Els productes de reacció es van separar per SDS-PAGE i es van tacar amb Coomassie Brilliant Blue (C, a dalt) i es va detectar nsp9-His6 radiomarcat mitjançant imatges de fosforescència (C, mig).Utilitzant proteïna de tipus salvatge (pes) com a referència (establert al 100%), es va calcular l'activitat relativa de NMPylation (mitjana ± SEM) a partir de tres experiments independents.( D ) Els títols de virus al sobrenedant de cultiu de cèl·lules p1 de cèl·lules Huh-7 infectades amb cèl·lules Huh-7 de tipus salvatge HCoV-229E i mutants que portaven substitucions d'aminoàcids designades a nsp9 es van determinar mitjançant un assaig de placa.El doble mutant DD4823/4AA del motiu C RdRp amb deficiència de replicació es va utilitzar com a control negatiu.
El terminal N de nsp9 (especialment les posicions 1, 2, 3 i 6) està molt conservat entre els membres de la subfamília Orthocoronavirinae (apèndix SI, figura S6).Per estudiar el possible paper d'aquests residus en la NMPylation nsp9 mediada per nsp12, es van substituir dos residus Asn consecutius a l'extrem N-terminal de nsp9 per Ala o Ser (sols o en combinació).En comparació amb nsp9 de tipus salvatge, la substitució de N3825 per Ala o Ser va donar lloc a una reducció de més de dues vegades en la UMPylation mediada per nsp12 (figura 5C).D'acord amb la nostra conclusió que la NMPylation es produeix a l'amina primària N-terminal en lloc de la cadena lateral del residu N-terminal, vam observar una NMPylation residual significativa amb la substitució de N3825A i N3825S.Curiosament, si el segon Asn es substitueix per Ala o Ser, la UMPylation nsp9 es redueix amb més força (més de 10 vegades), mentre que la substitució d'Ala a les posicions 3, 4 i 6 només té un efecte moderat sobre la UMPylation de nsp9 (Figura 2). ).5C).Es van obtenir resultats similars utilitzant ATP, CTP o GTP (apèndix SI, figura S8).Col·lectivament, aquestes dades indiquen el paper clau de N2826 (posició 2 a nsp9) en la NMPylation de nsp9.
Per tal d'obtenir proves addicionals de la correlació funcional entre l'extrem N-terminal de nsp9 i la NMPylation, vam realitzar una alineació de seqüències múltiple (MSA) de la seqüència nsp9 de la família del Coronavirus (variant entre 104 i 113 residus) (apèndix SI, figura). S6).En total, en 47 espècies (conegudes i putatives) de 5 gèneres de la subfamília Orthocoronavirinae que infecten diferents mamífers, aus i hostes de rèptils, només es va trobar que 8 residus en total eren invariants.Els canvis més extensos, incloses les supressions i les insercions, es van observar en els cicles entre els elements d'estructura secundària de nsp9, tal com van determinar estudis estructurals anteriors (26-28).Es van trobar cinc residus invariants a la cadena β i l'hèlix α de la part C-terminal de nsp9.Tres residus invariants constitueixen el motiu NNE de l'extrem N de nsp9.Es revela que el segon Asn d'aquest motiu és l'únic residu invariant, que també comparteix l'hipotètic nsp9 del coronavirus de granota llunyà, i representa l'espècie Microhyla letovirus 1 de la subfamília Letovirinae d'Alphaletovirus.La conservació de residus en elements d'estructura secundària nsp9 es pot racionalitzar per consideracions estructurals per mantenir les propietats de plegament o d'unió a l'ARN conegudes.Tanmateix, aquest raonament no sembla aplicar-se a la conservació de NNE, i abans d'aquest estudi, la naturalesa de les restriccions que limiten la variació de la seqüència del tripèptid estava completament enfosquida.
Per tal de determinar la importància de la nsp9-NMPylation i la conservació de NNE en la replicació del coronavirus, vam produir mutants HCoV-229E, que porten substitucions simples o dobles de residus N-terminals de nsp9, cosa que indica que la nsp9 NMPylation és perjudicial in vitro.Abans de començar, intentem respondre a la pregunta de si aquestes substitucions (a prop del lloc de clivatge nsp8|9) afecten el processament proteolític de la regió pp1a C-terminal.Es va produir un conjunt de construccions de poliproteïnes nsp7-11 que contenien les substitucions corresponents a l'extrem N de nsp9 a E. coli i es van tallar amb Mpro recombinant.La divisió proteolítica dels quatre llocs (inclòs el lloc flanquejant nsp9) no es veu afectada significativament per cap substitució introduïda (apèndix SI, figura S9), excloent els canvis estructurals en aquestes proteïnes que interfereixen amb la divisió nsp8 | 9 mediada per Mpro (o un altre) lloc web.
Les cèl·lules Huh-7 es van transfectar amb ARN HCoV-229E de longitud del genoma, que codificava substitucions Ala o Ser en els tripèptids NNE conservats (N3825, N3826 i E3827) a l'extrem N nsp9, demostrant que la majoria de les mutacions són mortals.Vam poder rescatar el virus substituint el Ser o Ala de l'Asn N-terminal (N2835A o N2835S), però no vam poder recuperar el virus amb altres mutacions simples i dobles en la seqüència NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Figura 5D).
Aquests resultats indiquen que la replicació de coronavirus en cultiu de teixits està restringida (igual o similar), limitant la mutació natural dels llocs de NMPylation nsp9 al cos i donant suport al paper clau d'aquesta resposta en el cicle de vida dels coronavirus.
En l'últim conjunt d'experiments, vam produir His6 C-terminal marcat amb SARS-CoV-2 nsp12 i nsp9, i dues formes mutants de nsp12 a E. coli.Els residus del lloc actiu als dominis NiRAN i RdRp eren, respectivament, Use Ala (Figura 6A i apèndix SI, taula S2).K4465 a SARS-CoV-2 nsp12 correspon a K4135 a HCoV-229E (apèndix SI, figura S2), que es va demostrar que era necessari per a l'activitat de NiRAN i la replicació de HCoV-229E (figura 3D i E).Aquest residu també correspon al residu del virus arterial EAV nsp9 K94, que anteriorment es va demostrar que era necessari per a l'auto-UMPylation/auto-GMPylation de NiRAN (16).Com es mostra a la figura 6B, SARS-CoV-2 nsp12 té activitat de transferasa UMP utilitzant nsp9 com a substrat, mentre que el mutant del lloc actiu nsp12_K4465A està inactiu.La doble substitució a la seqüència característica SDD del motiu RdRp C no afecta l'activitat de la transferasa UMP (figura 6B), cosa que indica que l'activitat de RdRp no té cap efecte directe en la UMPylation nsp9.Es van obtenir dades similars mitjançant CTP, GTP i ATP (apèndix SI, figura S10).En resum, aquestes dades indiquen que la NMPylation nsp9 mediada per NiRAN té una activitat conservadora en coronavirus que representen diferents gèneres de la subfamília ortocoronavirus.
NMPilació de nsp9 mediada per SARS-CoV-2 nsp12.(A) Gel SDS-poliacrilamida tenyit de Coomassie que mostra la proteïna recombinant utilitzada a la prova de NMPylation.Com a control, es va utilitzar una proteïna mutant amb substitució de lloc actiu al domini NiRAN (K4465A) i al domini RdRp (DD5152/3AA) de SARS-CoV-2 nsp12.La numeració de residus es basa en la posició a pp1ab.(B) Autorradiografia de detecció d'UMPylation utilitzant nsp9-His6 i [α-32P]UTP com a substrat de nsp12-His6 (tipus salvatge [wt] i mutant).La massa molecular (en kilodaltons) de la proteïna marcada es mostra a l'esquerra.
Els dominis NiRAN es conserven generalment a Nidovirales (16), cosa que indica que catalitzen reaccions enzimàtiques essencials per a la replicació de Nidovirus.En aquest estudi, vam poder demostrar que el domini NiRAN del coronavirus transfereix NMP (generat a partir de NTP) a nsp9, una misteriosa proteïna d'unió a l'ARN implicada en la replicació del virus (26 ?? 29), per determinar-la com a objectiu natural i soci de coronavirus RTC.
El domini NiRAN comparteix tres motius de seqüència (AN, BN i CN), que contenen un nombre molt reduït de residus que es conserven en totes les famílies de l'ordre Nidovirales monofilètic però molt diferenciat (8, 16).Estudis recents han demostrat que estan relacionats estructuralment amb una família de proteïnes semblants a les proteïnes cinases en gran part no caracteritzades, que originalment es van anomenar família SelO (17, 19, 22, 30, 31).Les proteïnes relacionades amb SelO tenen plecs de cinasa, però no tenen diversos residus de llocs actius conservats a les quinases clàssiques (22, 32).A partir de l'orientació inversa de les molècules d'ATP unides al lloc actiu i estabilitzades per interaccions específiques, es va plantejar la hipòtesi de SelO i posteriorment es va confirmar que transferia AMP (en lloc de fosfat) al substrat proteic (22), mentre que una altra proteïna bacteriana semblant a SelO, YdiU, té recentment s'ha demostrat que catalitza la unió covalent d'UMP als residus Tyr i His de diferents substrats proteics (33).
Per confirmar i ampliar la predicció dels residus del lloc actiu putatiu del domini NiRAN del coronavirus, hem utilitzat mètodes bioquímics i de genètica inversa per realitzar anàlisis de mutacions en el coronavirus nsp12 (Figura 3D i apèndix E i SI, Figura S3 i taula) S1â S4).Les dades mostren que la substitució de HCoV-229E K4135, R4178 i D4280 per Ala elimina l'activitat de la transferasa NMP in vitro i la replicació del virus en cultiu cel·lular (figura 3D i apèndixs E i SI, figura S3), donant suport a la seva presència en NTP γ-fosfat. (K4135, R4178) i la coordinació dels ions metàl·lics del lloc actiu (D4280).Es va demostrar que la substitució E4145A del Glu conservat a l'abast del virus del niu de l'ocell previst per estabilitzar la posició K4135 (17) eliminava la replicació viral, però sorprenentment, l'activitat es va mantenir en l'assaig de NMPylation in vitro (Figura 3D i E i Apèndix SI, figura S3 i taules S1–S4).Una observació similar es va fer quan es va introduir la substitució corresponent a l'homòleg YdiU de Salmonella typhimurium (E130A) (33).En conjunt, aquestes dades donen suport a la funció reguladora d'aquest residu conservat en lloc de la funció catalítica.
La substitució del residu de Phe conservat (F4281A) dins del rang de nestovirus al domini HCoV-229E NiRAN (8) va provocar una disminució de l'activitat de NMPylation in vitro i una disminució significativa de la replicació del virus en cultiu cel·lular (Figura 3D, E i SI) apèndix, figura S3).Les dades són coherents amb la funció reguladora important d'aquest residu, com ara el residu Phe del motiu DFG homòleg mostrat anteriorment.En les proteïnes quinases clàssiques, forma part del bucle d'unió de Mg2+ i ajuda a muntar i regular la columna vertebral???Necessari per a una activitat catalítica efectiva (32, 34).La substitució d'Ala i Arg per residus K4116 (al motiu preAN), respectivament, va eliminar la replicació viral i, com s'esperava, va tenir diferents efectes sobre l'activitat de la transferasa NMP in vitro, depenent de la cadena lateral d'aminoàcids introduïda (Figura 3D i apèndixs E i SI). , figura S3).Les dades funcionals són coherents amb la informació estructural, cosa que indica que aquest residu ha establert una interacció amb el fosfat ATP (17).Al domini NiRAN d'altres famílies de virus imbricades, la posició de HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 està ocupada per Lys, Arg o His (8), cosa que indica que la restricció funcional d'aquest residu específic s'ha relaxat.La substitució de D4188A i D4283A elimina o redueix fortament l'activitat de l'enzim i elimina la replicació del virus (figura 3).Aquests dos residus es conserven en la majoria (però no en tots) virus nidificats (8), cosa que indica una funció important específica de la família però possiblement no catalítica.Com a controls es van utilitzar substitucions d'Ala de diversos altres residus Lys i Asp (K4113A, D4180A, D4197A i D4273A) que no es conserven a les famílies Coronaviridae o altres Nestioviridae (8).Com era d'esperar, aquestes substitucions són en gran part tolerables, amb una lleugera disminució de l'activitat enzimàtica i la replicació viral en alguns casos (figura 3 i apèndix SI, figura S3).En general, les dades de mutagènesi del coronavirus són molt coherents amb les dades d'auto-GMP i genètica inversa d'EAV NiRAN-RdRp (16), en què EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) residu K94 (corresponent a HCoV-229E K4135) funcions importants), R124 (corresponent a R4178), D132 (corresponent a D4188), D165 (corresponent a D4280), F166 (corresponent a F4281).A més, les dades de mutagènesi de HCoV-229E són coherents i ampliades a partir de les dades de genètica inversa SARS-CoV informades anteriorment (16), igual de semblants a les observades per al motiu CN corresponent al mutant Phe-to-Ala SARS-CoV_nsp12. fenotip descrit -F219A i HCoV-229E_F4281A (figura 3 D i apèndix E i SI, figura S3 i taula S1-S4).
En comparació amb els ortòlegs EAV (16), que tenen una clara preferència per UTP i GTP (en la reacció d'auto-NMPylation), el nostre estudi mostra que el domini NiRAN del coronavirus (representat per HCoV-229E i SARS-CoV-2) pot ser eficaç. transferits Els quatre NMP, tot i que hi ha una lleugera preferència per UMP (figures 1 i 3).L'especificitat relativament baixa del cosubstrat NTP específic és coherent amb l'estructura supercomposta SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 recentment informada, en la qual ADP-Mg2+ s'uneix al lloc actiu de NiRAN, però no amb la part d'adenina. de la formació d'interaccions específiques (17).En el nostre estudi, el tipus de nucleòtid utilitzat en la reacció de NMPylation no té cap efecte diferencial sobre l'activitat de la proteïna mutant (apèndix SI, figura S3), cosa que indica que cap d'aquests residus està estretament relacionat amb la unió d'una nucleobase específica.Queda per estudiar la base estructural i la significació biològica potencial de les diferents preferències de cosubstrat NTP observades en els dominis NiRAN de coronavirus i virus arterials;poden ser certs o poden ser deguts a les limitacions dels seus respectius estudis.En l'actualitat, no es pot descartar que la potencial activitat NMPylator del domini NiRAN del virus arterial (en comparació amb l'activitat d'autoNMPylation caracteritzada anteriorment) tingui una preferència de cosubstrat diferent, tenint en compte que la similitud entre l'artèria i el coronavirus El domini NiRAN està al seu límit.Comparació basada en seqüències (16).En comparació amb la pseudoquinasa SelO, que utilitza Mg2 + com a cofactor, l'activitat del coronavirus i el virus arterial NiRAN depèn de Mn2 + (16) (figura 3C i apèndix SI, figura S1).La dependència de Mn2+ i la preferència òbvia per l'UTP és una característica inusual dels NMPylators de proteïnes, i només recentment s'ha confirmat a la proteïna YdiU de Salmonella typhimurium, que catalitza l'estricta proteïna dependent de Mn2+ UMPylation per protegir les cèl·lules de la inducció d'estrès del grup d'ATP cel·lular ( 33).
La semblança estructural descrita recentment entre el domini NiRAN del coronavirus i les proteïnes cinases cel·lulars (17, 19) proporciona suport addicional per a la capacitat de NiRAN d'enllaçar covalentment NMP amb altres proteïnes que hem informat en aquest estudi.Vam centrar la nostra recerca de possibles objectius NiRAN en les proteïnes codificades per HCoV-229E ORF1a, que se sap que ajuden directament o indirectament la replicasa codificada per ORF1b de RTC (12, 35).Els nostres experiments proporcionen proves concloents de la NMPylation eficaç i específica de nsp9 (figura 2).Si la proteïna diana s'utilitza en un excés molar que és de 8 a 10 vegades superior al de l'enzim (nsp12), es confirma que nsp9 està completament (mono)NMPitzat (figura 4).Vam concloure que la interacció entre nsp12 i nsp9 és de curta durada i no formarà un complex estable amb nsp9 (en absència d'altres subunitats RTC).Aquesta conclusió es recolza en estudis d'interacció de proteïnes sobre el proteoma SARS-CoV (35).L'anàlisi de MS va identificar l'amina primària del residu N-terminal de nsp9 com el lloc de NMPylation (apèndix SI, figura S5).La formació de l'enllaç fosforamidat i el grup amino N-terminal distingeix l'activitat de NMPylation mediada per NiRAN de la reacció d'AMPilació mediada per SelO de Pseudomonas syringae, que catalitza la formació d'AMP lligat a O a l'adducte pèptid de residus Ser, Thr o Tyr ( 22), i S. typhimurium YdiU forma aductes pèptids-UMP enllaçats O (amb Tyr) i N-enllaçats (amb His).La informació limitada disponible sobre la família de proteïnes SelO indica que els membres d'aquesta gran família de proteïnes difereixen molt en la formació d'aductes pèptid-NMP.Aquesta és una observació interessant que mereix més estudi.
Les dades obtingudes en aquest estudi ens van portar a plantejar la hipòtesi que la NMPylation de nsp9 requereix un N-terminal lliure.En el context de la replicació viral, això serà proporcionat per la divisió proteolítica del lloc de processament nsp8|nsp9 a la poliproteïna replicasa pp1a mediada per Mpro i pp1ab.En la majoria de coronavirus, la diferència entre aquest lloc específic (VKLQ | NNEI a HCoV-229E) i tots els altres llocs de ruptura de coronavirus Mpro és Asn (en lloc d'un altre petit residu, com Ala, Ser o Gly) ocupa P1â???Ubicació (36).Les dades d'escissió de pèptids obtingudes en els primers estudis van mostrar que l'eficiència de divisió del lloc nsp8 | nsp9 era inferior a la d'altres llocs, cosa que indica que 1) aquest lloc específic pot tenir un paper regulador en el processament coordinat oportunament del C-terminal. regió pp1a, o 2) a El paper de l'extrem N-terminal nsp9 conservat especial en la replicació del virus (37).Les nostres dades (figura 5A) van mostrar que la forma recombinant de nsp9 que portava la seqüència N-terminal real va ser NMPitzada efectivament per nsp12.La seqüència de flanqueig N-terminal es va eliminar mitjançant el factor Xa (nsp9-His6; apèndix SI, taula S1) o la divisió mediada per Mpro (nsp7-11-His6; figura 5A i apèndix SI, taula S1).És important destacar que el precursor sense tallar nsp7-11-His6 que conté nsp9 va mostrar resistència a la NMPylation de nsp12, que és coherent amb les nostres dades, cosa que indica que l'adducte nsp9-NMP es forma a través de l'amina primària N-terminal (apèndix SI, figura S5) .Per obtenir una comprensió més profunda de l'especificitat del substrat NiRAN, després ens vam centrar en els residus N-terminals adjacents de nsp9.En absència d'altres proteïnes, són estructuralment flexibles, cosa que evita que es detectin en la forma no marcada de nsp9 (26, 28, 38), cosa que indica la seva limitada variació natural. Això es deu a la important seqüència específica (no relacionada amb l'estructura secundària) funció del fragment N-terminal nsp9.Les substitucions Ala de residus conservats en aquesta regió (figures 5C i D i apèndix SI, figura S8) revelen que N3826 és essencial per a la NMPylation de nsp9 in vitro, mentre que les substitucions de N3825A i E3827A condueixen a una disminució de la NMPylation, mentre que les substitucions de M3829A i P3830A no ho fan. .Òbviament afecta la NMPylation nsp9.Tot i que la substitució d'Asn N-terminal (N3825A, N3825S) només té un efecte moderat sobre la NMPilació de nsp9 i la replicació del virus en cultiu cel·lular (figura 5C i D), la supressió d'una seqüència de residus d'Asn del dipèptid 3825-NN N-terminal demostrat que és letal per als virus, cosa que indica que es requereix un residu d'Asn abans d'un altre residu a l'extrem N, preferiblement Asn, tot i que sembla que la substitució de residus similars es pot tolerar parcialment (figura 5B, C i D).Arribem a la conclusió que el dipèptid 3825-NN, especialment el residu N3826 conservat i essencial dins del rang del coronavirus (apèndix SI, figura S6), garanteix la unió i l'orientació correctes de l'extrem N-terminal nsp9 al lloc actiu de NiRAN.
La substitució d'Ala (E3827A) pel Glu conservat de totes les subfamílies conserva la NMPilació nsp9 in vitro, però és letal per als virus en cultiu cel·lular (figura 5C i D), indicant la funció addicional d'aquest residu, per exemple, en interaccions clau (NMPilat o no modificat). ) nsp9 N-terminal i altres factors implicats en la replicació del virus.Les mutacions de Nsp9 no van afectar el procés proteolític de nsp9 ni de cap nsps adjacent (39) (apèndix SI, figura S9), cosa que indica que els fenotips letals de diverses mutacions de nsp9 observades no van ser causats per la desregulació de l'àrea pp1a terminal del procés proteolític C. .
Les dades anteriors proporcionen evidència que després del tractament mediat per Mpro del lloc de divisió nsp8 | 9 a pp1a/pp1ab, l'extrem N-terminal de nsp9 es pot UMPilar (o modificar parcialment amb un altre NMP).A més, l'excel·lent conservació de l'extrem N de nsp9 (inclosos els residus d'Asn singulars i invariants de la família de coronavirus) i les dades de genètica inversa obtingudes en aquest estudi (figures 3E i 5D) ens van portar a concloure que la NMPylation de nsp9 descrita. està relacionat biològicament i és essencial per a la replicació del coronavirus.Les conseqüències funcionals d'aquesta modificació encara s'han d'estudiar, per exemple, pel que fa a l'activitat d'unió a l'ARN de nsp9 (forma no modificada) descrita anteriorment (2628).La NMPylation N-terminal també pot afectar la interacció de nsp9 amb proteïnes o substrats d'ARN o la formació de diferents conjunts de quatre nivells.Aquests s'han observat en estudis estructurals i s'ha confirmat que estan relacionats funcionalment amb la replicació del coronavirus, encara que sobretot en absència de En el cas d'aquesta modificació (26-ââ29, 40).
Tot i que l'especificitat objectiu del domini NiRAN del coronavirus encara s'ha de caracteritzar amb més detall, les nostres dades mostren que l'especificitat objectiu de la proteïna del domini NiRAN del coronavirus és molt estreta.Tot i que la conservació dels residus clau del lloc actiu (8, 16) al domini NiRAN de totes les famílies de nidovirus dóna suport fortament a l'activitat del NMPylator conservat aquestes proteïnes, la identitat dels residus de butxaca d'unió al substrat d'aquest domini encara s'ha de caracteritzar. , i poden diferir entre diferents famílies de propòsits de Nidovirales.De la mateixa manera, encara s'han de determinar els objectius rellevants d'altres virus imbricats.Poden ser ortòlegs remots de nsp9 o d'altres proteïnes, perquè les seqüències fora dels cinc dominis de replicasa que generalment es conserven en virus nius estan menys conservades (8), inclosa la matriu de genoma entre Mpro i NiRAN, entre elles, nsp9 es troba a la corona virus.
A més, actualment no podem descartar la possibilitat que el domini NiRAN tingui objectius addicionals (inclosos els cel·lulars).En aquest cas, val la pena esmentar que els homòlegs bacterians d'aquesta proteïna emergent NMPylators (NMPylators) (30, 31) semblen tenir "reguladors mestres"?NMP modula una varietat de proteïnes cel·lulars per regular o eliminar les seves activitats aigües avall, jugant així un paper en una varietat de processos biològics, com la resposta a l'estrès cel·lular i l'homeòstasi redox (22, 33).
En aquest estudi (figures 2 i 4 i apèndix SI, figures S3 i S5), vam poder demostrar que nsp12 va transferir la part UMP (NMP) a una única posició (conservada) a nsp9, mentre que altres proteïnes no es van modificar en el utilitzat En les condicions, s'admet una especificitat de substrat ben definida (en lloc de solta).D'acord amb això, en comparació amb la NMPylation nsp9 N-terminal, l'activitat de NMPylation pròpia de nsp12 és molt baixa, la seva detecció requereix un temps d'exposició a autorradiografia més llarg i s'utilitza un augment de 10 vegades de la concentració de nsp12.A més, la nostra anàlisi de MS no va proporcionar proves de NMPylation de nsp12, cosa que suggereix que l'autoNMPylation del domini NiRAN és (en el millor dels casos) una activitat secundària.Tanmateix, cal assenyalar que altres estudis han proporcionat proves preliminars que l'estat d'auto-AMPilació del NMPylator bacterià pot controlar la seva activitat de NMPylation en altres substrats proteics (22, 33).Per tant, es necessiten més investigacions per investigar els possibles efectes funcionals de les activitats d'auto-NMPylation informades per a EAV nsp9 (16) i coronavirus nsp12 (aquest estudi), inclòs l'efecte semblant a la chaperona proposat sobre el plegament del domini RdRp C-terminal ( 16)).
Anteriorment, s'han considerat diverses hipòtesis sobre les possibles funcions aigües avall del domini NiRAN nidoviral, incloses l'ARN lligasa, la guanilat transferasa coberta amb l'ARN i l'activitat de preparació de proteïnes (16), però cap d'elles és compatible amb les funcions aigües avall disponibles.La informació obtinguda en les posicions següents és exactament la mateixa hora sense fer hipòtesis addicionals.Les dades obtingudes en aquest estudi són més coherents amb (però no poden demostrar) que el domini NiRAN està implicat en l'inici de la síntesi d'ARN induïda per proteïnes.Abans es creia que la funció del domini NiRAN en 5??Aquestes dades i el suport d'altres dades no afecten les reaccions de captació de ²-RNA o de lligament d'ARN.Per tant, per exemple, es considera que el lloc actiu de NiRAN implica l'Asp conservat com a base general (D252 a Pseudomonas syringae SelO; D4271 a HCoV-229E pp1ab; D208 a SARS-CoV-2 nsp12) (Apèndix SI, figura 2). ).S2) (17, 22, 33), mentre que la catàlisi de l'ARN lligasa i l'enzim de captació de l'ARN depenent de l'ATP la porta a terme l'enzim covalent-(lisil-N)-NMP intermedi, que implica un residu Lys no modificat ( 41).A més, la notable especificitat basada en la seqüència del coronavirus NiRAN per a dianes de proteïnes conservades i l'especificitat relaxada per als cosubstrats NTP (prefereix UTP) s'oposa a l'enzim de captació mediat per NiRAN o a les funcions semblants a l'ARN lligasa.
Òbviament, es necessita molt treball addicional per verificar i, si es demostra, aprofundir en el possible paper de nsp9-UMP (nsp9-NMP) en la síntesi d'ARN induïda per proteïnes, que connectarà diversos informes interessants però (fins ara) informats anteriorment. .Observacions aïllades.Per exemple, s'ha determinat que el final de l'ARN de cadena negativa del coronavirus comença amb una cadena oligo(U) (42, 43).Aquesta observació és coherent amb la idea que la síntesi d'ARN de cadena negativa s'inicia unint la forma UMPilada de nsp9 a la cua poli(A) (disparadors), que pot ser promoguda per la seva unió a l'ARN L'activitat i/o la interacció amb una altra proteïna RTC.La part UMP proporcionada per nsp9 es pot utilitzar com a "primer" per a l'oligouridilació mediada per nsp7/8/nsp12, utilitzant la cua 3??²-poli(A) a l'ARN genòmic o una altra seqüència que conté oligo (A) serveix com a plantilla, similar al mecanisme establert per a la proteïna VPg del picornavirus (44).Què passa si la proposta és "no normativa"????L'inici de la síntesi d'ARN de cadena negativa (induïda per proteïnes) proporciona un enllaç a les observacions, que indica que l'ARN de cadena negativa del coronavirus té UMP (en lloc d'UTP) al seu extrem (42), cosa que es considera que indica que el àcid nucleic Dicer escinda l'extrem fosforilat per una endonucleasa específica de la uridina desconeguda.Si es confirma, aquesta activitat hidrolítica de l'àcid nucleic pot ajudar a alliberar la forma oligomèrica UMPilada de nsp9 de l'extrem 5 ² de la cadena negativa naixent.El possible paper de nsp9 en la preparació de proteïnes també és coherent amb estudis anteriors de genètica inversa, que han demostrat que nsp9 (i nsp8) interaccionen de manera crítica i específica amb l'element d'ARN d'acció cis conservat a prop de l'extrem 3 del genoma del coronavirus.45).Segons aquest informe, aquestes observacions anteriors ara es poden tornar a examinar i ampliar mitjançant investigacions posteriors.
En resum, les nostres dades van determinar l'activitat específica d'una etiqueta enzimàtica de virus imbricada propietat vinculada a RdRp a l'extrem N-terminal.En el coronavirus, aquesta activitat UMPylator/NMPylator mediada per NiRAN recentment descoberta s'utilitza per dependre de Mn2 + i residus d'Asn adjacents i provocar la formació d'enllaços fosforamidat (de baixa energia) amb l'amina primària N-terminal.Mitjançant la divisió mediada per Mpro al lloc de divisió nsp8 | 9, l'objectiu nsp9 es pot utilitzar per a la NMPylation, indicant l'acoblament funcional entre la proteasa i el domini NiRAN, que s'estén a RdRp.La conservació de residus clau al lloc actiu de nsp12 NiRAN i l'objectiu nsp9, combinada amb les dades obtingudes de dos coronavirus, inclòs el SARS-CoV-2, proporciona una forta evidència que la NMPylation nsp9 és un coronavirus Les característiques conservadores també són un pas clau en la replicació del virus.Les dades disponibles ens porten a concloure que el paper específic de la forma NMPilada de nsp9 en la síntesi d'ARN induïda per proteïnes és un escenari raonable per al coronavirus i altres virus nius, i NiRAN també pot orientar-se a altres proteïnes no identificades.Regular el virus.Interacció amb l'amfitrió.Si es confirma, la implicació d'encebadors de proteïnes en la síntesi d'ARN viral augmentarà l'afinitat de la seqüència dels dominis Mpro/3CLpro i RdRp entre el coronavirus detectat anteriorment i el supergrup similar al picornavirus (9), que ara s'han unificat en les recentment establertes Pisonivirites (9). 46) a la categoria.
Les nostres dades també mostren que les activitats enzimàtiques bàsiques, selectives i conservadores identificades en aquest estudi es poden utilitzar com a dianes de fàrmacs antivirals.Els compostos que interfereixen amb la unió (i la modificació posterior) de l'extrem N-terminal nsp9 conservat al lloc actiu de NiRAN es poden convertir en fàrmacs antivirals eficaços i versàtils, adequats per al tractament de coronavirus animals i humans de diferents infeccions de (sub)gènere. , inclòs el SARS-CoV-2 i el coronavirus de la síndrome respiratòria de l'Orient Mitjà.
La seqüència de codificació de la proteïna coronavirus produïda en aquest estudi es va amplificar mitjançant RT-PCR mitjançant ARN aïllat de Huh-7 infectat amb HCoV-229E o Vero E6 infectat amb SARS-CoV-2 i inserit mitjançant procediments de clonació estàndard.Vector d'expressió pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) o pASK3-Ub-CHis6 (47) (apèndix SI, taules S1 i S2).Les substitucions de codons únics es van introduir mitjançant mutagènesi dirigida al lloc basada en PCR (48).Per produir la proteïna de fusió MBP, les cèl·lules TB1 d'E. coli es van transformar amb la construcció de plasmidi pMAL-c2 adequada (apèndix SI, taula S1).La proteïna de fusió es va purificar mitjançant cromatografia d'afinitat d'amilosa i es va escindir amb factor Xa.Posteriorment, la proteïna marcada amb His6 C-terminal es va purificar mitjançant cromatografia d'afinitat metàl·lica immobilitzada amb Ni (Ni-IMAC) tal com es va descriure anteriorment (49).Per produir la proteïna de fusió d'ubiquitina, les cèl·lules TB1 d'E. coli van utilitzar la construcció plasmídica pASK3-Ub-CHis6 adequada (apèndix SI, taules S1 i S2) i l'ADN plasmidi pCGI que codificava la hidrolasa C-terminal 1 específica de la ubiquitina (Ubp1).Transformació (47).La proteïna del coronavirus marcada amb His6 C-terminal es va purificar tal com es va descriure anteriorment (50).
La prova d'auto-NMPylation de HCoV-229E nsp12-His6 es va realitzar tal com es descriu a EAV nsp9 (16).En resum, nsp12-His6 (0,5 µM) conté àcid 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetansulfònic (HEPES)-KOH 50 mM, pH 8,0, ditiotreitol (DTT) 5 mM, MnCl2 6 mM, tampó incubat 25 µM, el NTP especificat i 0,17 µM van coincidir amb [α32-P]NTP (3.000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) a 30 ° C durant 30 minuts.En tots els altres assajos de NMPylation (estàndard) de NMPylation nsp9 mediada per nsp12, les condicions de reacció s'ajusten de la següent manera: nsp12-His6 (0,05 µM) i nsp9-His6 (4 µM) en presència de 50 mM HEPES-KOH (pH 80. ), 5 mM de DTT, 1 mM de MnCl2, 25 µM de NTP indicat i 0,17 µM de [α32-P]NTP.Després d'incubar durant 10 minuts a 30 °C, la mostra de reacció es va barrejar amb tampó de mostra SDS-PAGE: 62,5 mM de tris(hidroximetil)aminometà HCl (pH 6,8), 100 mM de DTT, 2,5% de SDS, 10% de glicerol i 0,005% de bromofenol. blau.La proteïna es va desnaturalitzar escalfant a 90 ° C durant 5 minuts i es va separar amb un 12% de SDS-PAGE.El gel es fixa i es tenyeix amb una solució Coomassie Brilliant Blue (40% de metanol, 10% d'àcid acètic, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), es decolora i s'exposa a una pantalla d'imatge fosforescent durant 20 hores (per detectar nsp12 de NMPylation) o (màxim) 2 hores (per avaluar la NMPylation nsp9).Es va utilitzar una imatge Typhoon 9200 (GE Healthcare) per escanejar la pantalla i ImageJ es va utilitzar per analitzar la intensitat del senyal.
Per a l'anàlisi de MS, es van utilitzar 1 µM de nsp12-His6 i 10 µM de nsp9 (sense etiqueta d'hexahistidina) en l'anàlisi de NMPylation (apèndix SI, taula S1) i es va utilitzar la concentració augmentada de 500 µM UTP i GTP.Depenent de la seva concentració i la qualitat de proteïna esperada, es va utilitzar un sistema HPLC Waters ACQUITY H-Class equipat amb una columna MassPrep (Waters) per dessalar d'1 a 10 µL de solucions de proteïnes tamponades en línia.La proteïna dessalada s'elueix a la font d'ions electrospray de l'espectròmetre de masses Synapt G2Si (Waters) a través del següent gradient de tampó A (aigua/0,05% àcid fòrmic) i tampó B (acetonitril/0,045% àcid fòrmic), i la temperatura de la columna és 60 ° C i un cabal de 0,1 ml/min: elució isocràtica amb 5% A durant 2 minuts, després un gradient lineal al 95% B en 8 minuts, i mantenir el 95% B durant 4 minuts més.
Es detecten ions positius amb un rang de massa de 500 a 5000 m/z.El glu-fibrinopèptid B es mesura cada 45 segons per a la correcció automàtica de la deriva de la massa.Utilitzeu el programari d'instruments MassLynx amb l'extensió MaxEnt1 per desconvolucionar l'espectre mitjà després de deduir la línia de base i suavitzar.
El HCoV-229E nsp9 UMPilat es va digerir afegint tripsina modificada de grau de seqüenciació (Serva) i es va incubar durant la nit a 37 ° C.Es va utilitzar una columna de rotació Chromabond C18WP (número de peça 730522; Macherey-Nagel) per dessalar i concentrar els pèptids.Finalment, el pèptid es va dissoldre en 25 µL d'aigua, que contenia un 5% d'acetonitril i un 0,1% d'àcid fòrmic.
Les mostres es van analitzar per MS mitjançant un espectròmetre de masses Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).El sistema HPLC nanoâ definitiu (Dionex), equipat amb un dispositiu personalitzat de 50 cm?Columna C18 RP de 75 μm empaquetada amb perles magnètiques de 2,4 μm (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Connecteu-vos a l'espectròmetre de masses en línia mitjançant la font de nanoespray Proxeon;injecteu 6 µL de solució de digestió de tripsina en un diàmetre interior de 300 µm ×??Columna de preconcentració C18 PepMap d'1 cm (Thermo Scientific).Utilitzant aigua/àcid fòrmic al 0,05% com a dissolvent, la mostra es va atrapar i dessalar automàticament a un cabal de 6 µL/min.
Els següents gradients d'aigua/0,05% àcid fòrmic (solvent A) i 80% acetonitril/0,045% àcid fòrmic (solvent B) es van utilitzar per aconseguir la separació de pèptids tríptics a un cabal de 300 nL/min: 4% B per 5 minuts, després un gradient lineal de 30 A al 45% B en qüestió de minuts i un augment lineal al 95% de dissolvent B en 5 minuts.Connecteu la columna cromatogràfica a un nanoemissor d'acer inoxidable (Proxeon) i ruixeu l'eluent directament al capil·lar escalfat de l'espectròmetre de masses utilitzant un potencial de 2.300 V. L'exploració de l'enquesta amb una resolució de 60.000 a l'analitzador de masses Orbitrap està associada. amb almenys tres exploracions MS/MS de dades, excloses dinàmicament durant 30 segons, utilitzant dissociació induïda per col·lisió de trampa d'ions lineal o dissociació de col·lisió d'energia més alta combinada amb detecció d'orbitrap. La resolució és de 7.500.
Hora de publicació: 03-agost-2021